Écotoxicité de l'exposition des larves du poisson zèbre au mélange EE2/A6: Un accent particulier sur la ligne latérale postérieure, PLL

Résumé

La ligne latérale postérieure ou PLL est un système mécano-sensoriel présent chez les poissons et les amphibiens, qui permet la détection des mouvements de l’eau dans l’environnement. La stimulation de ce système conduit à une réponse comportementale adaptée, telle que la nage contre le sens du courant, la parade sexuelle, la détection des proies et des prédateurs. Il a disparu chez les organismes terrestres et notamment chez la plupart des tétrapodes, où il a été remplacé par une autre structure, l’oreille interne. L’objectif de notre présente étude est d’évaluer les effets des mélanges de perturbateurs endocriniens sur la régénération de la PLL du poisson zèbre. L'exposition des larves âgées de 24 h pendant 6 jours aux composés d'éthinylestradiol EE2 et de biopesticide A6 a provoqué un retard de la régénération de nerf et des cellules ciliées. Ces résultats pourraient conduire à des effets graves à long terme sur la plasticité et la réparation neuronale et suggèrent que la perte de cellules ciliées auditives est irréparable chez les mammifères, plus particulièrement chez l'être humain.

Mots clés: Ligne latérale postérieure (PLL), mélange d’EE2/A6, exposition, régénération, nerf, cellules ciliées

INTRODUCTION

Les milieux aquatiques représentent souvent l’exutoire ultime de nombreuses substances d’origine anthropique (Sumpter, 1998). Plusieurs travaux, menés en laboratoire ou dans le milieu naturel ont révélé des effets néfastes de ces substances sur la faune et notamment sur Les poissons (Vos et al., 2000). De nombreuses études ont établi un lien direct entre la présence de composés à action perturbateur endocrinien dans ces milieux et l’apparition des effets délétères de nombreuses fonctions vitales chez certains organismes aquatiques (Vos et al., 2000).

La ligne latérale postérieure (PLL) du poisson zèbre est constituée d’un ensemble d’organes mécano-sensoriels, les neuromastes, disposés sur la surface du corps et répartis de manière équidistante à partir de la région otique jusqu’au niveau de la queue où on observe deux à trois neuromastes terminaux. Ces organes sont composés d’un groupe de cellules ciliées, entourées de cellules supports et qui sont innervées par des neurones sensoriels localisés dans les ganglions de la ligne latérale au niveau de la tête du poisson. Le signal nerveux est déclenché par la vibration des cils sous l’effet des mouvements de l’eau.

La ligne latérale postérieure (PLL) est formée par un nerf long et superficiellement localisé, et par des cellules ciliées des neuromastes qui sont localisées le long de la surface de corps et innervés par les axones sensoriels formant le nerf de la PLL (Ghysen et Dambly-Chaudière, 2004). Le développement superficiel du nerf permet d’effectuer une lésion localisée. La dynamique de la régénération complète des axones a été étudiée chez les larves du poisson zèbre 24 heures après axotomie (Villegas et al., 2012).

Les cellules ciliées des neuromastes du poisson zèbre présentent une morphologie et exècrent une fonction très semblables à celles de l’oreille interne des mammifères (Nicolson, 2005). Ces cellules sont externes et directement exposées à l’eau, où elles sont utilisées pour détecter la direction ainsi que les fluctuations et les changements de débit, ce qui aide le poisson à éviter les obstacles et les prédateurs et facilite également la détection des proies. Ces cellules ciliées peuvent se régénérer après des lésions via une trans-différenciation ou une prolifération des cellules supports (Burns et Corwin, 2013; Rubel et al., 2013).

Plusieurs chercheurs ont démontré que les cellules ciliées de la ligne latérale sont sensibles à l’exposition à des composés chimiques. Le système de la ligne latérale du poisson zèbre est donc un modèle rapide et efficace pour évaluer les effets d’un grand nombre de molécules environnementales sur la régénération du nerf et des cellules ciliées mécano-sensorielles (Froehlicher et al., 2009; Ou et al., 2010). Dans ce contexte, une exposition des larves du poisson zèbre durant 6 jours a été effectuée, suivie soit d’une coupure laser du nerf ou d’une incubation des cellules ciliées à la CuSO4 le 7ème jour de développement, afin d’évaluer la régénération de ces organes les jours suivants.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Déclaration d’éthique

Les animaux ont été traités dans le laboratoire Inserm U1198 conformément aux directives éthiques nationales et européennes. Le présent protocole expérimental a été approuvé par l’INSERM et l’Université de Montpellier sous le numéro de permis (accord n° A34-172-37). Le poisson zèbre est un poisson d’eau douce originaire d’Asie du Sud-Est (Engeszer et al., 2007). Sa petite taille, sa fécondité élevée, son cycle de vie court et sa reproduction facile en laboratoire sont des avantages pour les bio-essais toxicologiques. Le poisson zèbre est utilisé pour une variété d’études comportementales, développementales et éco-toxicologiques (Hill et Janz, 2003; Segner, 2009).

Expériences de traitement des embryons

Les poissons ont été manipulés selon la procédure standard du laboratoire (Westerfield, 2000). Les poissons adultes ont été maintenus à 28 °C, avec un rythme circadien de 14 h de lumière et 10 h d’obscurité, dans un système de recirculation et de flux continu où l’eau du réservoir est constamment filtrée. Les animaux ont été nourris deux fois par jour. Les embryons ont été obtenus à partir d’accouplements par paires.

Les neurones chez les larves ont été visualisés dans la lignée nbt-dsred (Peri et Nüsslein-Volhard, 2008), et la régénération des cellules ciliées a été évaluée dans les larves Brn3c:GFP, où toutes les cellules ciliées expriment la protéine fluorescente verte GFP (DeCarvalho et al., 2004). Les embryons ont été déchorionisés à 24 hpf pour des expositions expérimentales, puis maintenus dans l’incubateur dans des plaques à 6 puits. Dix à vingt embryons dans 2 ml de solution dans chaque puits ont été utilisés pour les études de la régénération des cellules nerveuses axonales (nerf) ou des cellules ciliées.

Évaluation des effets de mélange EE2/A6 sur la PLL

Régénération du nerf

Les embryons du poisson zèbre de lignée nbt-dsred ont été exposés entre 1 et 7 jpf (jours post fécondation) aux mélanges d’EE2/A6: MIX1= 0,5 nM/10 pM et MIX2= 50 nM/1000 pM ou au solvant témoin C (DMSO). Le nerf de la PLL des larves nbt-dsred exposées à ces concentrations a été coupé le 7ème jour avec un système laser Micropoint (Photonics Instruments, Pittsfield, MA, USA) adapté à un microscope Zeiss Axioplan 2 équipé d’un objectif (×40) à immersion dans l’eau. Pour visualiser la régénération axonale les jours suivants (8, 9 et 10 jours), les larves ont d’abord été incubées pendant 5 min dans de l’iodure de 4-(4-diéthylaminostyryl)-N-méthylpyridinium (DiAsp 2 g/mL, Sigma), un colorant vital absorbé par les cellules ciliées des neuromastes (Graciarena et al., 2014).

Les larves ont été ensuite anesthésiées et montées sur lame en dépression, et le nombre de neuromastes ré-innervés (détecté par la présence de branches axonales innervantes) a été évalué avec un Zeiss Axioimager équipé d’un objectif (×63) à immersion dans l’eau et d’une caméra Coolsnap. Le pourcentage de régénération fait référence au nombre de neuromastes ré-innervés par rapport au nombre total de neuromastes distaux de la coupe. Trois expériences indépendantes ont été réalisées pour l’étude de régénération du nerf de la PLL (n = 20) (Figure 1).

Régénération des cellules ciliées

Le protocole d’étude de la régénération des cellules ciliées consiste à traiter les embryons du poisson zèbre de lignée Brn3c:GFP âgées de 24 hpf avec les mélanges expérimentales EE2/A6 ; MIX1= 0,5 nM/10 pM, MIX2= 50 nM/1000 pM ou au solvant contrôle (DMSO)) pendant une durée de 6 jours. Les larves ont été incubées ensuite le 7ᵉ jour dans une solution de sulfate de cuivre à 10 μM durant 2 heures afin de tuer les cellules ciliées des neuromastes (d’Alençon et al., 2010), puis remis de nouveau dans des puits contenant les concentrations des mélanges étudiés. Les jours suivants (8, 9 et 10), la régénération des cellules ciliées a été suivie à l’aide d’un microscope Zeiss Axioimager équipé d’un objectif (×63) à immersion dans l’eau et d’une caméra Coolsnap, en la comparant à un contrôle DMSO. Trois expériences indépendantes ont été réalisées, n = 20 larves pour chaque condition (Figure 2).

Analyse statistique des données

Une ANOVA unidirectionnelle suivie d’une HSD de Tukey a été utilisée pour des comparaisons multiples pour l’analyse de la régénération de nerf et des cellules ciliées. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

RÉSULTATS

Régénération axonale du nerf de la PLL

Les effets mélanges des deux composés sur la régénération des axones de la PLL ont été évalués après une coupure laser en présence d’un témoin (DMSO) à partir de 1 jpf, suivi d’une coupure du nerf PLL juste après L1 (premier neuromaste) à 7 jpf, conduisant à une dégénérescence complète du nerf distal des larves de lignée nbt-dsred après quelques heures. Le niveau de régénération des axones a ensuite été mesuré 24 h, 48 h et 72 h post coupure (Nasri et al, 2016). La régénération axonale du nerf a été significativement retardée avec les faibles et les fortes concentrations des mixtures appliqués (Figure 3).

Régénération des cellules ciliées de la PLL

Les effets cocktail d’EE2/A6 sur la régénération des cellules ciliées ont été évalués après exposition des larves de lignée Brn3c::GFP. Le nombre de cellules ciliées régénérées a été compté après 24 h, 48 h et 72 h. Les résultats montrent que le mélange testé a ralenti la régénération de ses cellules, des effets substantiels étant observés principalement avec la mixture des deux concentrations les plus élevées de deux perturbateurs endocriniens (Figure 4).

DISCUSSION

Les perturbateurs endocriniens (PE) sont des composés qui interfèrent avec la signalisation hormonale (Zoeller et al., 2012) en affectant la synthèse, la sécrétion, le transport, la liaison, l’action ou l’élimination des hormones naturelles (Kavlock et al., 1996). Ce sont des molécules étrangères à l’organisme d’origine environnementale qui peuvent être des composés pharmaceutiques, des pesticides, aux modes d’actions complexes dont le plus documenté est celui de l’action via la liaison aux récepteurs à œstrogènes (ER). Toutefois, ils sont capables d’agir à de faibles concentrations, de l’ordre de nanomolaire sur des étapes très variées de la régulation endocrine, provoquant ainsi des altérations de plusieurs fonctions vitales comme le développement, la croissance et la reproduction. Jusqu’à présent, les recherches sur les PE se sont focalisées sur leurs effets sur les gonades et les tissus périphériques (la fonction de reproduction).

L’évaluation des effets de ces micropolluants est essentielle pour comprendre les conséquences biologiques à long terme. Dans ce contexte, nous avons utilisé le système sensoriel de la ligne latérale PLL facilement accessible pour évaluer les impacts de la mixture de deux perturbateurs endocriniens, le 17α-Ethynylestradiol (EE2), un constituant actif des préparations contraceptives, qui entraîne la libération continue de cet œstrogène synthétique dans les eaux de surface, et A6, un biopesticide dérivé d’un pesticide naturel α-terthienyle (une molécule isolée des racines de la plante d’astéracée (Tagetes erecta) (Nivsarkar et al., 2001). A6, présente des propriétés bleu-fuorescentes et succeptible d’exercer un effet perturbateur endocrinien (Nasri et al, 2016) où il est relié structurellement à une autre classe de pesticides: les anilinopyrimidines (cyprodinyle, pyriméthanyl et mepanipyrim) qui sont des PE (Fang et al., 2013).

Les résultats de la présente étude ont montrés que le mélange de EE2/A6 à faible et forte concentrations a entraîné un ralentissement de la régénération des axones du nerf et des cellules ciliées des neuromastes de la ligne latérale postérieure PLL des larves du poisson zèbre après exposition durant 6 jours. Ces données suggèrent que ces composés peuvent avoir des effets graves à long terme sur la plasticité neuronale et la réparation à ces concentrations. Ces résultats peuvent donner une idée sur l’impact chez l’être humain. Cependant, la perte de cellules ciliées auditives (et les dommages auditifs ultérieurs) est irréversible chez les mammifères, et par conséquent le système auditif des mammifères ne peut pas être réparé par la régénération des cellules ciliées de toute façon que ce soit.

Nous pensons donc que le principal composant des effets neurotoxiques du mélange expérimental EE2/A6 sur les larves de poisson zèbre réside dans la capacité de ces deux composés testés de se lier aux récepteurs à œstrogènes. Les récepteurs à ostéogène ER sont exprimés dans les neuromastes (Froehlicher et al., 2009), et impliqués dans le contrôle de la migration cellulaire au niveau de la ligne latérale postérieure du poisson zèbre (Gamba et al., 2010). De plus, il a été démontré récemment que chez le poisson zèbre, les récepteurs à estrogène (ER, gper) sont exprimés dans diverses régions du cerveau en développement, et que la perturbation de l’expression de ces récepteurs entraîne un retard de croissance et des défauts morphologiques dans le cerveau en développement, avec une prolifération réduite des cellules cérébrales et des anomalies dans le développement des neurones sensoriels et moteurs (Yanan Shi et al., 2013). Ces résultats sont tout à fait cohérents avec nos résultats de ralentissement de la régénération des cellules ciliées et des axones nerveuses après traitement avec le mélange EE2/A6.

CONCLUSION

En conclusion, les effets négatifs enregistrés relatifs au retard de la régénération des axones nerveuses et des cellules ciliées des neuromastes de la ligne latérale postérieure PLL sont initiés par la liaison des composés EE2/A6 aux récepteurs œstrogènes causant une altération des voies de signalisation de ces hormones. Toutes ces nouvelles données enrichissent la littérature scientifique et apportent des preuves supplémentaires sur les effets potentiels des perturbateurs endocriniens sur les organismes aquatiques et soulignent l’importance écotoxicologique des relations entre le développement nerveux et le système endocrinien.

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